Investigation of bacterial invasion and taxis behavior against normal and cancer cells using microfluidic system

Abstract

19세기부터 박테리아는 암 조직 또는 세포에 대해 지향성을 보이는 것이 관찰되어왔고, 이러한 현상에 착안하여 박테리아를 이용한 암 치료법을 개발하고자 하는 노력이 지속되고 있다. 박테리아는 선호하는 조건의 방향으로 능동적이고 빠르게 이동하는 특성을 보이며, 유전자 조작을 통해 보유하는 특성을 배가하거나 억제할 수 있어 현재 실시되고 있는 화학, 방사능 요법 등의 수동적인 암치료 방법의 효과적인 대안으로 각광 받고 있다. 실제 박테리아를 이용해 대장암과 유방암과 같은 몇 가지 고형 암의 경우 암을 지향하고 치료한 사례가 동물실험 결과를 토대로 보고된 바 있지만, 박테리악 암을 찾아내고 침투하는 직접적인 원인은 아직 밝혀지지 않고 있다. 이에 본 연구는 박테리아가 암과 정상 세포 사이에 박테리아 침투 및 세포사멸에 미치는 효과의 차이 확인과 박테리아의 표적 지향 성능에 대해 분석하여 박테리아가 암을 추적하는 근본적인 원인을 밝혀내고자 하였다. 본 연구에서는 암과 정상 세포 사이에 박테리아의 세포 침투 및 사멸의 차이 분석을 위해 간의 정상과 암 세포에 대항하는 THLE-2와 HepG2에 살모넬라 (Salmonella typhimurium)과 대장균 (Escherichia coli)을 일정시간 동안 감염시키고, 그 영향을 세포역학적인 관점으로 고찰하였다. 90분의 감염시간 동안 HepG2는 THLE-2에 비해 현저히 낮은 생존율을 보여 박테리아의 감염에 더 취약한 것으로 파악할 수 있었다. 살모넬라와 대장균의 감염은 각각 세포의 액틴 골격 구조의 급격한 변화와 미세소관의 해리를 유도하였고, 이는 HepG2에서 더 두드러지게 나타나는 것을 확인하였다. 이에 따라 균주에 따라 세포를 침투하는 경로가 다른 것을 예상할 수 있었으며, 정상 세포에 비해 암 세포가 더 원활한 침투가 이루진다는 것을 볼 수 있었다. 화학물 처리를 통해 액틴 골격 구조의 조절에 중요한 역할을 담당하는 마이오신 II의 활성을 조절한 결과 살모넬라 감염은 마이오신 II의 활성과 직접적인 상관 관계가 있음을 알 수 있었으며, 정량화를 통해 HepG2가 월등히 높은 양의 마이오신 II와 활성을 보유함을 확인할 수 있었다. 이에 따라 간 세포의 살모넬라의 침투는 마이오신 II의 활성에 따라 조절된다고 결론 지을 수 있었다. 반면 대장균 감염의 경우, 미세소관의 해리를 억제를 통해 세포의 생존률이 월등히 증가하는 것을 확인함에 따라 미세소관의 해리가 간세포로의 대장균 침투에 필수적임을 확인할 수 있었다. 박테리아가 암을 선호하는 원인은 암 조직의 발생과 성장과정에서 유추할 수 있다. 암 조직은 정상의 조직과 비교하여 비정상적으로 빠른 증식으로 하게 되는데, 이로 인해 조직 내부에 균일하지 않은 산소와 영양분 공급이 발생하게 되고, 암 조직은 이를 극복하기 위해 혈관 등의 생성을 유도하는 생화학적인 물질들을 과분비하게 된다. 따라서 박테리아가 암을 지향하는 특성은 암 조직 내의 원활하지 못한 산소 공급으로 인해 발생하는 산소 결핍 환경과 박테리아가 암 세포에서 특이적으로 분비되는 생화학적 물질에 대해 보이는 주성이라 추정할 수 있다. 하지만 현재까지 박테리아가 암을 찾아내는 정확한 원인은 밝혀지지 않고 있다. 이에 본 연구에서는 박테리아가 정상세포에 비해 암세포를 선호하는 직접적인 원인을 분석할 수 있는 미세 유체 플랫을 설계 및 제작하였다. 설계된 소자는 다중의 세포를 독립적인 공간에서 배양함과 동시에, 콜라겐 막의 다공성의 성질을 이용해 세포 배양을 통해 발생하는 여러 물질들을 중앙 박테리아 채널로 확산을 통해 농도 구배를 형성할 수 있도록 설계되었고, 이를 통해 박테리아 지향성의 정량적인 분석을 가능케 했다. 간 정상과 암세포에 대한 살모넬라와 대장균의 지향성 분석 결과, 두 균주 모두 암세포에 대해 높은 지향성을 보이는 것을 관찰하였으며, 이는 각 균주에 따라 서로 다른 물질에 의한 것임을 확인하였다. 마지막으로, 조직과 유사한 3차원의 환경을 구축할 수 있는 미세유체플랫폼을 개발하고, 이를 이용해 암, 정상 조직, 혈관으로 이루어진 미세환경에서의 박테리아 암 추적 및 침투 기작을 분석하였다. 박테리아는 숙주 내에서 혈관을 통해 이동하고 침투하여 암에 도달하기 때문에 암 세포가 혈관에 미치는 영향을 분석하고, 또 이것이 박테리아의 침투에 어떤 영향을 미치는지에 대한 분석이 필요하다. 개발된 미세유체플랫폼을 이용해 혈관 내피세포 성장 인자의 농도 구배를 유도하여 루멘의 구조를 가지는 안정된 혈관을 형성하였다. 이 후 형성된 혈관이 간 암과 정상세포와 함께 각각 공생배양되었을 때, 간 암세포가 혈관의 투과율을 높여 보다 더 빠른 성장을 유도하는 것을 관찰하였다. 박테리아가 형성된 혈관에 주입되었을 때, 암 세포의 방향으로 박테리아의 뚜렷한 지향성을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 암의 환경이 주위 혈관의 혈관내피세포간의 결합의 약화를 통한 혈관의 투과성을 높여 더 빠른 혈관의 생성을 유도하는 것을 알 수 있었으며, 결국 이 과정은 박테리아의 침투에 긍정적인 영향을 미침을 파악할 수 있었다.