Development of bioprocess for production of valuable chemicals using Corynebacterium glutamicum

Abstract

빠른 산업발전에 따른 환경오염문제 및 자원고갈문제가 대두됨에 따라 전세계적으로 이를 해결하기 위한 노력이 절실히 요구되고 있다. 그러나, 기존 경제 및 산업체계에서 석유 및 화석자원이 단순 에너지 차원만이 아닌 다양한 산업의 기본적 화합물을 제공해왔기 때문에 이를 완전히 대체하기에는 어려움이 따른다. 이러한 상황에서 최근 곡물, 목재, 볏짚, 사탕수수 등과 같은 생물체가 만들어낸 바이오 매스를 이용한 바이오리파이너리가 석유화학산업의 대안으로 제시되고 있다. 특히 바이오 연료와 바이오 화합물은 석유자원 기반으로 구성된 현재 산업 시스템을 그대로 이용할 수 있는 큰 장점을 가지고 있어 많은 기대를 받고 있다. 하지만 바이오리파이너리의 성공적인 산업화를 산물질의 생산성, 경제성 등의 많은 난제가 남아있다. 이를 해결하기 위해서는 바이오 공정에 핵심촉매로 사용되는 미생물 호스트 균주의 우수성이 확보되어야 하며, 보다 경제적인 공정시스템이 요구된다. Corynebacterium균주는 그람양성균으로서, 산업시스템에서 아미노산의 생산 균주로 사용되고 있다. 또한 Corynebacterium균주는 고농도의 세포배양, 유기화학소재에 대한 높은 내성을 가지고 있으며, 유전자조작이 용이함에 따라 다양한 산업에서 생산 균주로서 활용되고 있다. 따라서 본 연구는 Corynebacterium을 이용하여 고부가가치 화학소재 중 원자재 화학소재인 아크릴 아마이드와 방향족 화합물인 파라-하이드록시벤조익 산의 새로운 생산 균주개발 연구를 수행하였다. Corynebacterium기반의 고부가가치 바이오화학소재 전환균주 및 생산용 미생물 platform으로 제시하고자, chapter 1에서는 Corynebacterium에서 TIR의 이차구조 instabil-ity 및 consensus RBS를 도입하여 NHase의 over-expression을 유도하였고, 배지조성 및 배양조건 최적화를 이루어 높은 생산 수율을 가지는 재조합 Corynebacterium을 제작하였다. 재조합 Corynebacterium은 산업에서 사용하고 있는 전환균주인 R.rhodochrous보다 배양시간을 줄일수 있는 장점을 가지며, 또한 total activity가 4배 높기 때문에 기존의 acrylonitrile로부터 acrylamide 생산방법과 비교하여 더욱 경제적인 생물전환 공정을 제공할 수 있을 것이다. Chapter 2에서는 Corynebacterium을 기반으로 pHBA의 생산대사경로 및 율속단계를 분석하고, 대사공학 및 효소공학을 통해 고효율 생산균주를 제작하고자 하였다. 대사경로를 분석해본 결과, tryptophan, phenylalanine 및 tyrosine에 의해 feedback inhibition을 일으키는 AroF와 pHBA에 의하여 product inhibi-tion을 일으키는 UbiC는 일차적으로 해결해야 했다. 따라서 AroF의 경우 기존 보고된 mutation에 의해 해제된 유전자를 사용하기 결정하였고, UbiC의 경우 구조기반 합리적 설계기술과 dynamic 분석을 통해 7.7~8.2배 product inhibition이 완화된 돌연변이체를 개발하였다. 이어서 대사경로에서 pHBA의 전구체인 chorismate의 pool을 증대하기 위해 trpE, csm 및 pobA 유전자를 삭제하였고, 돌연변이체인 AroF와 UbiC를 Coryne-bacterium에 도입하였다. pHBA의 생산 및 수율을 확인하기 위해 발효를 수행한 결과, 최대 4.3g/L의 생산성을 가짐을 확인하였고, 4.1%(g/C-g)의 생산수율을 가짐을 확인하였다. 이와 더불어 생체대사경로내의 pHBA는 식품산업, 화장품산업 및 제약산업의 많이 사용되는 vanilin(년 1만톤 수요), 미백, 항산화 물질로 사용되는 hy-droquinone(년 2만톤 수요) 및 C5이상 바이오화학소재로 nylon66, 가소제 및 polyure-thane제조의 필수 monomer인 adipic aicd(년 230만톤 수요)의 중간대사물질로 알려져 있다. 따라서, 제작된 pHBA 생산균주는 다양한 고부가가치 방향족 화학소재의 생산 platform으로써 사용이 가능할 것이며, 이는 석유기반 화학적 생산 기술의 대체할수 있는 범용성을 갖는 기반 미생물의 개발 및 원천기술 확보에 큰 기여할 것이라고 예상된다.