본 개시는 상호정보량 최소화를 통한 다색 분리 방법 및 장치를 제공한다. 본 개시에서는, 상이한 생체 분자들에 각각 표지되어 있는 복수, 예컨대 n 개의 형광 물질들에 대해, 복수의 이미지들을 획득하고, 획득된 이미지들 중 두 개로 각각 구성되는 쌍들의 각각에 대해, 쌍들의 각각의 이미지들 사이에서 공유되는 상호정보량을 감소시키면서, 획득된 이미지들로부터 형광 물질들 각각에 대한 이미지들을 분리할 수 있다. 본 개시에 따르면, 하나의 파장대에서 각각의 발광 스펙트럼이 중첩되는 셋 이상의 형광 물질들의 신호들을 분리할 수 있다. 구체적으로, 형광 물질들의 각각의 발광 스펙트럼 측정 없이, 형광 물질들의 수와 동일한 개수의 검출 파장대에서 얻은 이미지들만으로도 형광 물질들 각각에 대한 이미지들을 분리할 수 있다.