Structural and functional study on DNA receptor proteins in innate immune system

Abstract

선천성 면역시스템은 미생물의 침입에 대항하여 식균작용과 염증반응으로 첫번째 방어막을 제공한다. 숙주세포에 바이러스나 박테리아가 감염되면, 미생물 병원체들은 다양한 종류의 핵산물질을 세포질로 배출한다. 세포질에 존재하는 많은 DNA 센서들은 (DAI, IFI16, DD41, DNA-PK, MRE11, cGAS) 이러한 다양한 종류의 핵산물질을 인식하고, STING에 의존하는 신호전달 체계를 활성화시켜 1형 인터페론을 유도한다. 다수의 DNA 센서들이 세포질에서 발견되었지만, 왜 그렇게 많은 DNA 센서들이 존재하는지, 어떻게 그들이 서로 상호작용하는지에 대한 이해가 부족하다. 아직 밝혀지지 않은 의문들 중, 우리는 cGAS의 N-말단 도메인의 구조적 기능적 연구를 수행하였고, DNA 센서들과 리간드들 간의 결합특성을 연구하였다. Cyclic GMP-AMP 합성효소 (cGAS)는 DNA결합으로 활성화되고, ATP와 GTP를 이용하여 cyclic dinucleotide, 2’, 3’ cGAMP, 를 합성한다. 그러나 현재까지의 연구는 cGAS의 N-말단부분 (~150 a.a.)이 제거된 도메인을 가지고 진행되었다. 우리는 cGAS의 N-말단부분을 따로 정제하여 DNA결합에 대한 구조적 연구를 수행하였고, cGAS의 효소 활동에서 N-말단 메인의 효과를 설명하기 위해 cGAS의 효소활동성을 관찰하였다. cGAS의 N-말단부분은 dsDNA와의 결합으로 구조적 변화가 유도되었다. cGAS의 N-말단의 구조는 완전한 랜덤코일에서 dsDNA와의 결합으로 부분적으로 짧은 α-helix와 β-sheet를 가지는 구조로 변화하였다. cGAS의 N-말단부분은 T23, R48, A68, M80근처의 유도된 helix들과 charge-charge in-teraction을 통해 DNA와 결합할 것이다. cGAS의 N-말단부분은 cGAS와 ΔN-cGAS의 DNA결합강도의 차이에 원인이 되고, ΔN-cGAS와 dsDNA의 결합강도는 dsDNA의 길이에 따라 달라진다는 사실을 확인하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 우리는 cGAS의 효소활성에서도 cGAS N-말단의 효과를 확인하는 것이 필요하다고 생각했다. 2’, 3’ cGAMP를 생산하는, ΔN-cGAS의 효소활성은 전체 cGAS의 효소활성과 비교하여 15%이상 감소하였다. 전체 cGAS가 DNA의 길이에 관계없이 비슷한 양의 2’, 3’ cGAMP를 만드는데 반해, ΔN-cGAS에 의해 만들어지는 2’, 3’ cGAMP의 양은 DNA가 길어질수록 감소하였다. 그리고 감소된 ΔN-cGAS의 효소활성은 따로 정제된 cGAS 말단부분을 넣어주자 회복되었다. 이러한 결과들을 통해, cGAS의 N-말단부분이 cGAS의 효소활성에서 co-effector로써의 역할을 하는 것으로 보인다. DNA 센서들과 결합파트너간의 결합적 특성들을 연구하기 위해 여러 생화학적 실험들을 수행하였다. 첫번째로, STING의 C말단 부분과 dsDNA, c-di-GMP와의 결합을 EMSA와 ITC를 통해서 확인하였다. STING의 C말단 부분과 c-di-GMP와의 결합강도는 0.21uM로 dsDNA와의 결합강도 (14.12uM)보다 강했다. 흥미롭게도, STING C말단과 dsDNA의 결합반응의 에너지차이는 c-di-GMP와의 결합반응에서의 에너지 차이보다 10배정도 컸다. 이러한 에너지의 차이는 STING의 C말단과 dsDNA의 결합으로 인해 만들어지는 구조적 차이에 의해 만들어진다고 생각할 수 있다. STING C말단과 c-di-GMP의 복합체와 dsDNA와의 결합강도는 24.5uM로, STING C말단과 dsDNA와의 결합강도 (14.12uM) 와 비슷한 수준을 보였다. 이를 통해 SITNG C말단에서 c-di-GMP과 dsDNA가 서로 다른 결합자리를 가지고 있는 것을 알 수 있다. 두번째로, DDX41과 결합파트너들 (dsDNA, c-di-GMP, STING) 의 결합강도를 ITC를 통해 확인하였다. DDX41은 STING C말단과 직접적으로 결합하였다. DDX41과 dsDNA와의 복합체 또한 STING C말단과 결합할 수 있는데, 결합강도가 DDX41과 STING C말단과의 결합보다 강하다는 점을 확인하였다. 이는 dsDNA와의 결합에 의해 일어나는 DDX41의 어떤 구조적인 변화가 STING C말단과 상호작용을 더 잘하게 한다는 점으로 생각할 수 있다. 마지막으로, IFI16의 HINa, HINb, PYD 도메인들간의 분자내 상호작용과 STING C말단과의 결합은 확인되지 않았다. 그래서 IFI16의 HINa, PYD 도메인들의 역할은 아직 명확하지 않으므로, HINa와 PYD 도메인들의 기능, IFI16의 위치변화, 염증반응을 유도하는 메커니즘을 규명하기 위한 추가적인 실험이 필요하다.