Development of a total integrated valveless genetic analysis microsystem using a slidable chip

Abstract

미세전자기계시스템 (Micro electro mechanical systems

MEMS) 기술이 화학 및 생화학 검정에 소개된 후로 랩온어칩(LOC), 또는 미세종합분석시스템(μTAS)을 이용한 기술은 임상진단, 법의학, 식품안전, 환경검사 등의 분야에서 수십 년간 발전되어 왔다. 마이크로플루이딕을 기반으로 하는 미세종합분석시스템은 빠른 분석시간, 적은 시료의 사용, 각 단계의 통합의 용의성, 높은 처리용량과 이동의 간편함 등 여러 가지의 장점을 지니고 있다. 이러한 장점을 이용하여 sample-in-aswer-out이 가능한 완전히 통합된 마이크로 칩 기반의 유전자 분석 장치가 개발되었으며 이를 병원균 진단이나 유전자 분석 등에 적용하였다. 그러나 이렇게 개발된 통합 유전자 진단 장치는 마이크로 펌프나 밸프를 구동하거나 유체의 흐름을 조절하기 위한 외부의 장치가 필요하고 현장진단을 위한 이동형 검출장치 또한 필요하며 잘 훈련된 사람에 의해서만 작동될 수 있는 단점을 지니고 있다. 그리하여 본 학위논문에서는 이러한 점을 보완하여 DNA의 추출에서부터 중합효소연쇄반응 및 면역 크로마토그래피 분석법 또는 모세관 전기영동과 같은 검출 부분을 모두 하나의 칩에 통합시킨 유전자진단 마이크로 통합시스템을 고안하였다. 첫 번째로 인플루엔자 A 바이러스의 병원성과 아류형을 역전사 중합효소연쇄반응 이후 종이를 이용해 진단 할 수 있는 마이크로 장치 (PFAM)의 개발을 수행하였다. 본 마이크로 진단장치는 두 개의 테스트라인으로 구성되어 있는데 인플루엔자 A 바이러스의 M gene을 검출할 수 있는 테스트라인과 haemagglutinin gene을 검출을 통해 H1N1, H3N2, H5N1의 바이러스 중에서 아형을 구분할 수 있는 테스트라인으로 구성되어 있다. M gene과 haemagglutinin gene (H1, H3, H5 gene)은 각각 Digoxigenin과 Texas Red가 포함되어 있는 프라이버를 이용하여 다중 역전자 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 증폭산물을 streptavidin이 코딩되어 있는 금 나노입자가 있는 마이크로 장치의 conjugation pad에 떨어뜨려 증폭과정 중에 DNA 사슬 중간에 넣은 biotin과 결합하게 한 뒤 결합체를 anti-Digoxigen과 anti-Texas Red가 각 각 뿌려져 있는 테스트라인으로 흘려주어 그 곳에 잡히도록 한다. 이 결과 인플루엔자 A H1N1, H3N2, H5N1은 10분안에 10^2 copy 측정 한계값으로 검출할 수 있었고 임상샘플 또한 정확히 검출되었으며 그 결과를 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time PCR)로 확인하였다. 두 번째로 인플루엔자 A 바이러스의 H1N1의 유전자 발현을 발색검출할 수 있는 역전사 중합효소 연쇄반응과 면역 크로마토그래피 분석법이 통합된 마이크로 장치를 개발하였다. Texas Red가 포함된 프라이머와 biotin-dUTP가 포함된 dNTP, 인플루엔자 A H1N1 바이러스의 RNA를 포함한 역전사 중합효소 연쇄반응용 용액을 마이크로 펌프를 이용해 중합효소 연쇄반응 챔버에 넣고 H1 gene을 증폭시켰다. Texas Red와 biotin을 포함한 증폭 산물은 이어서 면역 크로마토그래피 분석 스트립에 흘려주게 되면 먼저 항체가 고정되어 있는 금 나노입자와 결합한 뒤 streptavidin이 뿌려져 있는 테스트라인에 잡히게 된다. 테스트라인의 보라색을 관찰하여 H1N1 바이러스를 확인할 수 있었다. 마이크로 펌프, 2 μL 중합효소 연쇄반응 챔버, 면역 크로마토그래피 분석을 모두 휴대용 유전자 분석장치를 이용해 2시간 30분안에 수행 하였으며 14.1 pg의 RNA도 발색검출이 가능하였다. 세 번째로 고체상 핵산 추출-중합효소연쇄반응-면역크로마토그래피 분석법이 통합된 마이크로 장치를 개발하여 병원체를 발색-다중 검출하였다...